Учился в Саратове в рисовальной школе И.Ф. Ананьева, в студии живописи и рисования Саратовского общества любителей изящных искусств у В.В. Коновалова и Г.П. Баракки, в Московском училище живописи, ваяния и зодчества (1890-1891, 1893-1895), в Академии художеств в Санкт-Петербурге (1891-1893) у П.П. Чистякова и В.П. Верещагина, в студии Ф. Кормона в Париже (1895-1897). Член Московского товарищества художников (с 1899), Союза русских художников, участник выставок Московского товарищества художников, «Алая роза» (1904, Саратов), зарубежных.
Родился в Саратове 2 (14) апреля 1870 в семье железнодорожного служащего.В 1884 году Борисов-Мусатов поступает в саратовское реальное училище. Учителя рисования — сначала Ф.А. Васильев, а затем приехавший из Петербурга В. В. Коновалов — обращают внимание на его способности.
Вскоре Борисов-Мусатов оставляет училище и начинает серьезно заниматься живописью. От Коновалова он получает первые навыки мастерства, первые эстетические представления. В эти годы Борисов-Мусатой много рисует (чаще всего — сцены домашнего быта), пишет картину «Окно» (1886, ГТГ), детально, почти иллюзорно, изображая уголок сада с окном своего дома.В августе 1890 года молодой художник уезжает в Москву, в Училище живописи, ваяния и зодчества. Занятия там его не удовлетворяют, через год Борисов-Мусатов переезжает в Петербург и в качестве вольнослушателя начинает учебу в Академии художеств, посещая также частную мастерскую известного педагога П.П. Чистякова.
Весной 1893 года после операции художник из-за климата покидает Петербург и возвращается в Москву, в Училище. Лето Борисов-Мусатов обычно проводил в Саратове, где много работал над этюдами, в основном — пейзажными.
Его успехи в работе на пленере отразились в картине «Майские цветы» (1894, ГРМ). В этом солнечном пейзаже ощущаются непосредственность, свежесть восприятия жизни, что характерно для работ Борисова-Мусатова той поры.
Осенью 1895 года Борисов-Мусатов уезжает в Париж. Чтобы совершенствовать художественное образование, он поступает в мастерскую исторического живописца и педагога Фернана Кормона, много занимается рисунком, посещает Лувр, где восхищается Боттичелли. Среди «французов ему больше других близок Пюви де Шаванн.
Возвратившись через три года в Россию, он снова поселяется в Саратове. С этого времени в произведениях Борисова-Мусатова появляется свой почерк, свое видение мира. Борисов-Мусатов приходит в искусство на рубеже двух веков, в эпоху чрезвычайно сложную и исключительно богатую крупными творческими индивидуальностями. Однако рядом с Врубелем, Нестеровым, Серовым, Левитаном он находит в искусстве неповторимый самобытный путь.
Началом творческого пути художника явился «Автопортрет с сестрой» (1898, ГРМ), не имеющий аналогий в русском портретном искусстве. Необычно композиционное построение картины — центральное место занимает задумчивая молодая девушка в старинном белом платье. Фигура художника срезана краем холста и будто выходит за его рамки. Это вносит как бы элемент случайности, напоминая картины импрессионистов. Живописно вещь решена по-новому. В ней обобщены цвет и форма. Особенно в пейзаже дальнего плана, имеющем сходство с декорацией. В этой картине впервые начинает воплощаться мечта Борисова-Мусатова о совершенном, гармоничном мире, появляется стремление уйти от неустроенности окружающего в идеальную страну, созданную фантазией художника.
Такое настроение, захватившее многих представителей русской художественной интеллигенции рубежа XX века, становится лейтмотивом творчества Борисова-Мусатова. В его произведениях нет исторической конкретности, «это просто красивая эпоха», как говорил сам художник.
Вслед за автопортретом создается цикл лирических картин: «Осенний мотив» (1899, Саратовский гос. художественный музей им. А.Н. Радищева), «Мотив без слов» (1900, ГТГ), «Гармония» (1900, Москва, собрание А.В. Гордона). Борисов-Мусатов передает особую атмосферу угасающей красоты осенней природы, тишину старинных усадеб; ощутимы аромат ушедшей жизни, грустная поэзия давно минувших печалей любви. Содержание этих работ в какой-то степени навеяно летними поездками в имение Слепцовку, где он гостил у своего крестного — управляющего поместьем и где впервые глубоко почувствовал обаяние старины.
Расцвет творчества Борисова-Мусатова падает на начало XX века, когда были созданы наиболее совершенные работы художника: «Весна» (1898-1901, ГРМ), «Гобелен» (1901, ГТГ), «Водоем» (1902, ГТГ), «Изумрудное ожерелье» (1903-1904, .ГТГ) и другие.
Летом 1901 года Борисов-Мусатов посещает Зубриловку — поместье князей Прозоровских-Голицыных. С этого времени пейзажи зубриловского парка стали живой натурой для мастера и опоэтизированные богатой фантазией художника вошли во многие его произведения. Впечатления этой поездки отразились в картине «Гобелен». Среди декоративных растений парка две женские фигуры, — застывшие в легком изящном движении, органически соединенные с пейзажем. Название картины в какой-то мере определяет характер живописной формы. И пейзаж, и фигуры написаны очень обобщенно, плоскостно, колорит построен на созвучии больших цветовых пятен, краски мягкие, приглушенные — все это создает некоторое ощущение призрачности, красивого миража. В то же время декоративность, тонкость отношений вызывают ассоциации с благородными красками старинного гобелена.
На выставке Московского товарищества художников, в которое Борисов-Мусатов вступил в 1899 году, картина имела успех, что во многом изменило отношение к работам Мусатова, не сразу понятым и оцененным современниками. Вершиной творчества мастера явилась картина «Водоем» (1902, ГТГ), в ней поэтические грезы выражены в совершенной, законченной форме. Картина создавалась в счастливую пору жизни художника: девушка, которую он любил давно, дала согласие на брак.
Летом Борисов-Мусатов с сестрой Леной и невестой В.Е. Александровой живет в Зубриловке, пишет этюды и эскизы к картине, обе девушки позируют художнику. В картине «Водоем» все уравновешено, подчинено четкому и сложному музыкальному ритму линий и формы.
Строгому ритму подчиняется и цвет, построенный на повторении синих, нежно-сиреневых и зеленых сочетаний. Картина монументальна и в то же время лирична, глубоко интимные движения души художника выражены в как бы остановленном прекрасном мгновении, зачарованном, волшебном мире красоты. В 1903-1904 годах Борисов-Мусатов пишет своеобразное панно «Изумрудное ожерелье» (ГТГ): движущиеся на фоне переливов зелени женские фигуры cловно вплетены в орнамент из трав и листьев. Природа и человек так органично слиты, что возникает ощущение особой естественности, первозданности бытия.
В те же годы Борисов-Мусатов создает еще два полотна: «Прогулка при закате» (1903, ГРМ) — ясное, спокойное по настроению произведение — и «Призраки» (1903, ГТГ) — мрачное, со щемящим чувством тоски, внутренней напряженности полотно. Зубриловский парк с женскими тенями превращается у художника в туманное мистичное видение: вибрирующие, тающие очертания, блеклые, потухающие краски.
Весной 1903 года художник женится, а в декабре Мусатовы переезжают в Подольск, поближе к Москве и Петербургу. В начале 1903 года Борисов-Мусатов вступает в Союз русских художников, организованный в Москве после выхода группы художников из общества «Мир искусства». В это время его работы получают известность не только в России, но и за границей, успешно экспонируются в городах Германии и Франции.
Художника все более влечет монументальная живопись. В 1904-1905 годах он выполняет эскизы к декоративным росписям. Первая группа эскизов была сделана на конкурс, объявленный Московским управлением электрической тяги, и оказалась неудачной, но второй цикл — заказ для частного дома — представляет большой интерес. Четыре эскиза — «Весенняя сказка», «Летняя мелодия», «Осенний вечер» и «Сон божества» (ГТГ) — объединены общим названием «Времена года». Содержание передано в аллегорической форме. По эмоциональности эскизы созвучны ранее созданным работам Борисова-Мусатова. Росписи, однако, небыли осуществлены.
Весной 1905 года художник с женой и дочерью уезжает в Тарусу, там проходят последние месяцы его жизни и творчества. В Тарусе художник создает свои лучшие пейзажи: «На балконе. Таруса» (1905, ГТГ), «Куст орешника» (1905, ГТГ), «Осенняя песнь» (1905, ГТГ); написаны они нежными тающими красками и с большой силой обобщения. В них звучит мелодия угасания осенней природы, близкая душевному состоянию художника. В Тарусе Борисов-Мусатов создает и свое последнее произведение — большую акварель «Реквием» (1905, ГТГ), посвященную памяти безвременно умершего друга, Н.Ю. Станюкович — жены известного писателя. «Реквием» звучит печально-торжественно, символически передавая радости и горести человеческой жизни. Волею судьбы, это был реквием и самому автору.
В ночь на 26 октября 1905 года Борисов-Мусатов умер. Он похоронен в Тарусе на высоком берегу, над Окой.